Tout savoir sur la PCR
Définition :
La PCR (Polymerase Chain Reaction) est une réaction biochimique de synthèse ADN réalisée in vitro et de manière répétée, ce qui permet d'amplifier en grande quantité un fragment d'ADN à partir d'une matrice d'ADN qui contient ce fragment.
Comme tout processus de synthèse d'ADN, la polymérisation se déroule à partir d'une amorce oligonucléotidique[1] hybridée à une matrice simple brin d'ADN ; elle allonge le brin néosynthétisé de 5' en 3'. |  Synthèse d'ADN par polymérisation |
Principe de la PCR
L'originalité de l'approche de PCR est que :
- les deux brins du fragment d'ADN d'intérêt sont dupliqués simultanément, si bien qu'à l'issue d'un cycle de synthèse, le nombre de copies du fragment qui fait l'objet de l'amplification est multiplié par deux,
- le processus de synthèse de l'ADN est répété plusieurs fois successivement si bien que comme il y a duplication de l'ADN à l'issue de chaque cycle de synthèse, l'amplification de l'ADN est exponentielle.
Les étapes de la réaction de PCR
Une réaction de PCR se déroule par répétitions successives des trois étapes suivantes :
dénaturation de la matrice d'ADN (94°C, 30 secondes)
hybridation de la matrice avec les amorces (température d'hybridation à définir au cas par cas (voir ci-dessous), 30 secondes)
polymérisation d'ADN à partir des amorces et à l'image de la matrice (72°C, entre 30 secondes et 5 minutes selon la longueur du fragment d'ADN qui doit être amplifié).
Cet enchaînement d'étapes qui constitue un cycle d'amplification est reproduit successivement de 20 à 50 fois.
Pour que la réaction de PCR soit réalisable, on doit utiliser une ADN polymérase[2] thermotolérante, la TAQpolymérase. Le nom de cette ADN polymérase vient de l'organisme chez qui elle a été identifiée : Thermophilus aquaticus, bactérie qui vit dans des sources d'eau chaude. La TAQpolymérase supporte d'être chauffée à 94°C sans se dénaturer, elle fonctionne de manière optimale à 72°C.
Les versions les plus récentes des TAQpolymérases correspondent à des enzymes recombinantes "synthétiques", c'est-à-dire que plusieurs mutations ont été introduites dans les séquences des TAQpolymérases originelles de manière à améliorer les performances de l'enzyme.
