Principe de la PCR quantitative
Comme cela a été dit précédemment, la PCR est un processus d'amplification exponentielle de l'ADN. Cependant, il y a deux limitations.
La première est que les constituants présents dans le mélange réactionnel sont en quantité finie. Il arrive donc un moment où il n'y a plus assez d'amorces et/ou plus assez de nucléotides (dNTPs) pour que la réaction de synthèse d'ADN puisse continuer à se dérouler de manière exponentielle.
La seconde est que l'efficacité de la duplication n'est pas toujours totale. Il peut ainsi arriver qu'une proportion faible mais constante des amorces ne s'hybrident pas avec la matrice d'ADN à chaque étape d'hybridation des amorces. Cela peut être dû à une mauvaise conception des amorces, ou bien à un choix de température d'hybridation légèrement trop élevé.
 3 Phases de la réaction PCR | Toute réaction de PCR se déroule en trois phases :
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Limite de la PCR pour l'approche quantitative
La PCR n'est en général pas quantitative si on analyse le résultat de l'amplification à la fin du processus d'amplification, c'est-à-dire lorsque les échantillons se trouvent dans la phase stationnaire. Ceci est illustré sur le schéma suivant.
Si on analyse le résultat de la PCR au bout de 40 cycles, on constate que les quantités d'ADN amplifiées sont à peu près similaires pour tous les échantillons.
Or ces différents échantillons possédaient des quantités initiales très différentes. En effet, il faut moins d'une vingtaine de cycles de PCR pour pouvoir détecter des quantités significatives d'ADN dans l'échantillon bleu, alors qu'il faut plus de 30 cycles pour obtenir le même résultat à partir de l'échantillon rouge.
Par conséquent, si l'efficacité d'amplification est la même, l'échantillon rouge possédait beaucoup moins d'ADN matrice que l'échantillon bleu au début de l'expérience.
L'analyse "en point final" n'est donc pas appropriée pour déterminer la quantité d'une molécule d'ADN particulière dans un échantillon.
Attention :
Si on veut utiliser la PCR comme méthode de quantification, il est nécessaire d'analyser le processus d'amplification de l'ADN lorsqu'il se trouve dans la phase exponentielle.
Suivi de l'amplification en temps réel
Pour analyser le déroulement de l'amplification d'ADN dans la phase exponentielle, il est nécessaire de déterminer la quantité d'ADN produite par la réaction de PCR à la fin de chaque cycle.
Une astuce technique permet d'effectuer cette mesure "sans effort". Cette astuce consiste à ajouter au milieu réactionnel un agent intercalant de l'ADN qui soit fluorescent et dont la fluorescence varie selon que cet agent est incorporé à une double hélice d'ADN ou est libre dans la solution. Il existe différentes molécules qui possèdent ce type de propriété, mais la plus utilisée est le SYBR Green[1]. La quantité de SYBR Green intercalée dans la double hélice étant proportionnelle à la quantité et à la longueur des doubles hélices d'ADN présentes dans la solution, une simple mesure de fluorescence permet de connaître la quantité d'ADN présent en solution. |  |
Remarque :
Il existe d'autres méthodes de détection de la quantité d'ADN au cours du processus d'amplification, mais elles ne seront pas développées dans ce cours.
 Appareil de PCR quantitative | Les appareils qui permettent de faire de la PCR quantitative sont des thermocycleurs qui possèdent une capacité supplémentaire, celle de quantifier la fluorescence présente in situ dans chacun des tubes à la fin de chaque cycle d'amplification (voir schéma de l'appareil). Cette mesure permet d'accéder à la quantité d'ADN présente en solution à la fin de chaque cycle. Il est alors possible de construire des courbes de synthèse d'ADN telles que celles qui sont présentées sur la figure ci-dessus. On peut alors définir la phase d'amplification exponentielle, la phase transitoire et la phase stationnaire. Cette analyse en continu de l'amplification de l'ADN explique la dénomination de "PCR en temps réel". |
Pour plus d'informations, des vidéos sont à votre disposition :
