Facteurs influençant l'hybridation moléculaire
La température
Les molécules d'acides nucléiques double-brin se dénaturent à la chaleur, c'est à dire si on fournit une énergie supérieure à l'énergie de liaison qui associe les deux brins l'un avec l'autre.
En fonction de la température, les molécules vont se présenter sous forme double brin ou simple brin ou un mélange des deux.
La température de fusion (Tm ou Tf) est la température à laquelle la moitié de l'ADN est sous forme double brin et l'autre moitié sous forme monobrin.
On peut construire une courbe de dissociation de l'ADN en fonction de la température, par la mesure de l'absorbance à 260 nm car les molécules d'ADN simple brin et double brin n'ont pas la même absorbance.
La dénaturation d'une molécule d'ADN initialement sous forme double brin nécessite que la température soit élevée au-dessus de la température de fusion. La dénaturation est très rapide (quelques secondes).
La renaturation de deux monobrins dissociés nécessite que la température soit abaissée au-dessous de la température de fusion. La renaturation est un processus lent, de quelques secondes à plusieurs dizaines d'heures selon la complexité des deux brins d'ADN et leur concentration dans la solution. Une amorce s'hybridera en quelques secondes avec une matrice d'ADN parce que l'amorce a une séquence très courte et qu'elle est présente à une concentration extrêmement élevée. Un génome entier mettra plusieurs jours à se renaturer parce que sa séquence est très longue et complexe et que la concentration de chacune des régions de l'ADN est relativement faible.
La composition du milieu réactionnel
a) La teneur en sel et en particulier en cations monovalents type Na+
Les ions Na+ stabilisent les ions phosphate de la chaîne d'ADN et limitent la répulsion entre les chaînes monobrins. La présence de Na+ facilite donc la réassociation.
b) La teneur en produits chimiques : formamide
La formamide crée des liaisons H avec les bases azotées de la molécule d'ADN, donc la dénaturation sera plus rapide. La formamide aura tendance à déstabiliser les hybrides imparfaits.
Le rôle de différents constituants sur la Tf se traduit par la formule empirique de Tf, pour une molécule d'ADN de taille n supérieure à 100 pb et présentant un pourcentage en guanine et cytosine (noté %(G+C)) compris entre 30 et 70, propriétés intrinsèques de la molécule :
Tf (°C) = 81,5 + 16,6 log[Na+] + 0,41 % (G+C) - 600/n - 0,61 %.formamide
Définition : Stringence
La stringence est un ensemble de conditions expérimentales de température, de pH et de force ionique permettant l'hybridation moléculaire. La stringence est d'autant plus forte que la température est proche de la température de fusion et que la concentration en cations monovalents (Na+ par exemple) est faible.
Des conditions très stringentes (température élevée, concentration en Na+ faible) rendent l'hybridation moléculaire plus difficile mais permettent une hybridation spécifique tandis que des conditions peu stringentes (température plus faible, concentration en Na+ plus élevée) permettent une hybridation moins spécifique.
