Exercice : II - Amplification spécifique de séquence - Partie 1
On souhaite amplifier par PCR une partie de la séquence (donnée ci-dessous) du gène de la ß-6 tubuline du maïs.
« Rappel : la taille du génome haploïde du maïs est de 5 e+9 pb »
0001 TTTTAAGTTA CTGTGTGCTT GTTGCAGGAT CTGTAACTAA TTCCTATGCG ATTCTCTTGT
0061 TTGTAGGGCG AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT
0121 TGGCGCCAAG TTCTGGGAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCCTA CCGGGCGGTA
0181 CACTGGCAAT TCCGACCTTC AGTTGGAGCG TGTTAATGTC TACTACAATG AAGCCTCCTG
0241 CGGACGCTTT GTTCCCCGCG CTGTTCTCAT GGATCTTGAG CCTGGGACAA TGGACAGTGT
0301 CCGGACCGGA CCCTATGGGC AGATCTTCCG CCCTGACAAC TTTGTGTTTG GGCAATCTGG
0361 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCTGAGCTCA TTGACTCTGT
0421 TCTGGATGTT GTGAGGAAGG AAGCTGAGAA CTGTGACTGC TTGCAAGGAT TCCAAGTATG
0481 CCACTCCCTT GGTGGTGGTA CTGGATCTGG TATGGGTACG CTGTTGATCT CAAAGATCAG
0541 GGAAGAGTAC CCTGACCGCA TGATGCTTAC ATTCTCAGTT TTCCCCTCAC CGAAAGTATC
0601 TGATACCGTG GTTGAGCCAT ACAATGCCAC TCTTTCTGTC CACCAGTTGG TCGAGAATGC
0661 TGATGAGTGC ATGGTTCTCG ATAACGAAGC CCTCTATGAC ATCTGCTTCA GGACTCTTAA
0721 GCTGACCACC CCTAGCTTTG GTGATCTGAA CCATTTGATC TCTGCAACCA TGAGTGGAGT
0781 CACCTGCTGC CTAAGGTTCC CTGGTCAGCT GAACTCCGAC CTCAGGAAGC TGGCAGTGAA
0841 CCTGATCCCC TTCCCCCGTC TCCACTTCTT CATGGTCGGC TTCGCGCCGC TGACGTCCCG
0901 TGGCTCCCAG CAGTACCGGG CCCTCACAGT CCCCGAGCTC ACGCAGCAGA TGTGGGATGC
0961 CAAGAACATG ATGTGTGCCG CTGACCCTCG CCATGGGCGT TACCTCACCG CCTCGGCCAT
1021 GTTCCGCGGG AAGATGAGCA CCAAGGAGGT TGACGAGCAG ATGATCAACG TCCAGAACAA
1081 GAACTCGTCC TACTTCGTGG AGTGGATCCC CAACAACGTC AAGTCCAGCG TGTGCGACAT
1141 CCCGCCCAGG GGCCTGTCCA TGGCGTCCAC CTTCATCGGC AACTCGACCT CCATCCAGGA
1201 GATGTTCCGG AGGGTGAGCG AGCAGTTCAC TGCCATGTTC AGGAGGAAGG CTTTCTTGCA
1261 CTGGTACACG GGCGAGGGCA TGGACGAGAT GGAGTTCACC GAGGCCGAGA GCAACATGAA
1321 CGACCTCGTG TCGGAGTACC AGCAGTACCA GGACGCGACT GCCGACGAGG AGGAGTACGA
1381 GGACGAGGAG GAGGTGCAGG CCGATGACAT GTGAGGGGAG GGCTGTTATC GTGTGAAGCC
1441 TTGTGGTCCC TAGGGCAAGC GGACCTCGAT GAGTTCGGTG TTCCCTTTCG TGTTGTTGCC
1501 ATCTTTCTAC TGCTAGCGTA CCCACCCTCG TGGCCCATTC CGTCGCTGTT GACGTATGTA
1561 TTTTTCTTGT GCTATGGAAC CTTGCTTTTG GTACGGTACT ATCCTGCTAG TATGCTTGGC
1621 GTTTGAGGTT CCTGGCGTGA ATTTAAGCCT TCCGTATGCA GTGATTGGAG TTGGAGACCG
1681 GCTGCTTCGT CCAGGCGAAG CAATTGACAG CGACGTGCTA TACACTCAAG
Question
1 - Déterminez la séquence de deux amorces utilisables pour amplifier de façon spécifique environ 1 kilobase de la séquence du gène de la tubuline.
Les amorces doivent faire au moins 20 nucléotides
Séquences possibles :
5'- AACTGTGACTGCTTGCAAGG -3' (449-468)
5'- GAACACCGAACTCATCGAGG -3' (1483-1464)
Question
2 - Calculez la température de fusion (Tm) de chacune de ces deux amorces
Tm = 60°C et Tm = 62°C respectivement
Question
3 - Proposez un protocole d'amplification (température et durée des différentes étapes
Par exemple :
94°C 1 mn, 56°C 1 mn, puis 72°C 3 mn
Question
4 - Calculez le nombre de cycles théoriquement nécessaires pour obtenir 1 µg de ce fragment en partant soit de 10 ng, soit de 500 ng d'ADN génomique
29 cycles à partir de 10 ng
24 cycles à partir de 500 ng
