Exercice : III - Amplification spécifique de séquence - Partie 2
On a identifié un gène de tournesol (gène rhs) qui est impliqué dans la réponse à un stress hydrique: l'expression de ce gène est augmentée chez une variété tolérante au stress, alors qu'il n'y a aucune modification de son expression chez une variété sensible au stress hydrique. Les formes alléliques du gène rhs ont été clonés chez les deux variétés et leurs séquences ont été déterminées. Les séquences sont extrêmement homologues sauf au niveau d'une région dans laquelle est concentré l'essentiel des divergences :
Question
1 - A partir des données de séquence présentées ci-dessus, déterminez les séquences (d'au moins 20 nucléotides) d'amorces qui permettront d'amplifier spécifiquement chacune des deux formes alléliques du gène rhs.
Donnez les températures expérimentales d'hybridation des amorces que vous allez programmer sur votre thermocycleur « (appareil d'amplification de séquences) »
.
Il y a plusieurs possibilités. Par exemple:
pour la variété tolérante : amorce 1: GTAAAAATAGAAAGAAATGCAAA Tm=56°C ; amorce 2: CTCAAACCATACAATTATTTGA Tm=56°C
pour la variété sensible : amorce 1: GTAATAAAAGAAAGGAAAGCAAT Tm=58°C ; amorce 2: TGAGCCGTATCTGATCGTC Tm=58°C
Température expérimentale d'hybridation des amorces: pour la première PCR: 52°C. Pour la seconde 54°C.
Commentaire: ces température sont plutôt faibles. Il serait souhaitable de choisir des amorces plus riches en G ou C en décalant la région choisie pour l'amplification.
Question
2 - La transmission du caractère de tolérance au stress hydrique, d'une part, et la ségrégation des 2 allèles du gène rhs, d'autre part, sont ensuite étudiés dans la descendance de deuxième génération issue d'un croisement entre les deux variétés. Pour identifier les génotypes des différentes plantes issues du croisement au locus rhs, on se propose de réaliser une (ou plusieurs) amplification(s) spécifique(s) de séquence, dans les conditions définies dans la question a.
Comment doit-on procéder pour déterminer le génotype de chacun des descendants au locus « rhs »
?
On doit (i) extraire l'ADN des plantes, (ii) faire une première PCR avec le couple d'amorces choisi pour la variété tolérante dans les conditions de PCR adaptées à ce couple d'amorces, (iii) faire une seconde PCR avec le couple d'amorces choisi pour la variété sensible dans les conditions de PCR adaptées à ce couple d'amorces. Pour chacune des PCR, on doit ajouter l'ADN des parents et un échantillon d'eau, à titres de témoins et/ou de références.
