I - Mesure de la sensibilité de détection d'une puce à ADN
Afin d'évaluer le niveau d'expression des gènes d'une souche de Saccharomyces cerevisiae par hybridation à des micro-arrays d'ADN sur verre, on réalise la synthèse d'une sonde complexe d'ADNc à partir d'ARNm. La synthèse s'effectue en présence d'oligo(dT)-15, d'un mélange de nonamères aléatoires, des nucléotides dATP, dGTP, dTTP, dCTP, du nucléotide modifié Cy3-dCTP et de transcriptase inverse.
Question
1 - A quoi servent l'oligo(dT)-15 et le mélange de nonamères aléatoires ?
Oligo dT et nonamères aléatoires servent à amorcer la réaction de réverse transcription.
Si on considère qu'une molécule d'ARNm et sa copie ADNc ont la même masse, toutes les molécules d'ARNm n'ont pas été converties en ADNc.
Question
2 - Après la synthèse d'ADNc, une mesure de la densité optique à 260 nm montre que la quantité d'ADNc synthétisée est 0,6 μg alors qu'on avait mis en réaction 1 μg d'ARNm. Discutez.
Oligo dT et nonamères aléatoires servent à amorcer la réaction de réverse transcription.
Grâce à l'égalité A=ε l.c (l en cm, c en mol/l)
on peut écrire 0,1 = 150 000 lc on pose l=1cm trajet de la cuve
donc 0,1/ 150 000 = c, soit
c = 6,67 10-7 mol/l |
en Cy3 dans la solution d'ADNc
Question
3 -On mesure la quantité de Cy3-dCTP incorporé dans la sonde par la mesure de la densité optique à 550 nm (notée D.O.550).
Calculez la quantité totale (en pmoles) de Cy3-dCTP incorporé dans la sonde, sachant que D.O.550 = 0,1 U, que le volume V = 70 μl et que le coefficient d'extinction moléculaire du Cy3-dCTP, ε = 150 000 l mol-1 cm-1.
Calculez la fréquence d'incorporation du Cy3-dCTP pour 1000 nucléotides. On considérera que la masse molaire moyenne d'une base est 324 g
La fréquence d'incorporation est-elle identique pour tous les gènes ? Quel facteur influence le taux le marquage ?
Quantité en pmol de Cy3 incorporé :
On fait un tableau de proportionnalité
6,67.10-7 moles de Cy3 dans 10 6 µl
Combien dans 70 µl ?
x= 6,67.10-7 *70 * 10-6
x= 46,7 pmol de cy3 incorporées |
Fréquence d'incorporation pour 1000 nts :
Question : combien y a t il de « paquets » de 1000 nucléotides dans 0,6 µg d'ADNc ?
masse molaire moyenne d'une base 324g
Nbre de moles de 1000 nt | 1 | x |
Masse (g) | 324 000 | 6.10-7 |
X= 6.10–7/ 324 000= 18.10–13 moles de 1000 nt
Et sur ces 18.10-13 il y a eu 46,7 pmol de Cy3 incorporées.
Soit 46,7.10-12/ 18.10-13 = 25,24
Le taux d'incorporation du Cy3 pour 1000 nucléotides d'ADNc est de 25,24
La fréquence d'incorporation n'est pas la même, elle dépend de la teneur en G des ARNm.
Question
4- Le résultat de l'hybridation sur la puce d'ADN est évalué à l'aide d'un système de lecture qui permet de quantifier l'ADNc hybridé quand le nombre de molécules de fluorochrome Cy-3 est supérieur à 5 107 par spot.
Calculez le nombre minimum de molécules d'ADNc d'une espèce (correspondant à un gène) qui doivent être mise en jeu dans l'hybridation pour être détectées, sachant que 20 % des molécules constituant la sonde sont effectivement hybridées à l'ADN fixé sur la puce après 12 heures d'hybridation. On considérera que l'ADNc a une taille de 1000 bases.
Calculez, pour les conditions opératoires utilisées (1 μg d'ARNm mis en réaction), quelle doit être l'abondance minimale des ARNm d'un gène (exprimée en % des ARNm cellulaire) pour que l'expression de ce gène puisse être détectée.
« On considèrera que la taille des ADNc ou ARNm est de 1 kb et que la masse molaire d'un ADNc de 1 kb est de 3. 105 daltons. N= 6.1023 »
Calculez le seuil de détection du système exprimé en nombre de copies d'ARNm par cellule de levure sachant que le nombre total de molécules d'ARNm par cellule est 15 000.
Discutez les limites du système sachant que chez la levure, 19 % des ARNm sont présents à moins de 0,1 copie par cellule, 50 % entre 0,1 et 1 copie, et 31 % supérieurs à 1 copie par cellule.
Nombre minimum de molécules d'ADNc mises en jeu pour être détectées
Détection si au moins 5 107 molécules de Cy3 / spot
Or d'après la question précédente il y a 25,24 molécules de Cy3 pour 1 molécule d'ADNc de 1000 bases, combien y a t-il de molécules d'ADNc pour 5.107 molécules de Cy3 hybridées ?
X= 5.107/ 25,24 = 0,19.107
Or il n'y a que 20 % des molécules d'ADNc qui s'accrochent.
Donc il faut au minimum 0,19.107 *5 molécules d'ADNc pour permettre la détection soit
0,95.107 molécules soit environ 1.107 molécules d'ADNc.
Abondance minimale des ARNm d'un gène
Vu le rendement de synthèse de l'ADNc, (1 µg d'ARNm ont permis la synthèse de 0,6 µg d'ADNc) on peut dire que le nombre minimal de molécules d'ARNm est de (1/0,6) * 107 soit 1,67.107 molécules
Ces 1,67.107 molécules correspondent à 2,78.10-17 moles.
Sachant que la masse molaire moléculaire d'une mole de 1000 pb est arrondie à la valeur de 300 000 g,
On peut dire que la masse seuil de l'ARN m détectable est 8,35.10-6 µg. |
Soit 0,00083% de la masse initiale (1 µg d'ARNm) pas loin de 0,001%
Seuil de détection exprimé en nombre de copies d'ARNm par cellule
Le nombre total de molécules d'ARNm / cellule est de 15000.
En se servant du résultat précédent 15000* 0,83.10-5 = 12,45.10-2
soit seuil de détection d'un ARNm de la puce étudiée : 0,1245 copies par cellule.
Impossible de détecter les 19% d'ARNm présents à moins de 0,1 copies par cellule. Les autres ARNm sont détectables avec cette puce.
