II - Le commissariat à l'énergie atomique (CEA)
Le Commissariat à l'Energie Atomique (CEA) gère depuis plusieurs décades de nombreux sites contaminés par des métaux et des radionucléides résultant de la production d'armes conventionnelles ou nucléaires. Un programme de dépollution est actuellement mis en place.
Son objectif général est de développer des procédés de bio-dépollution qui seraient appliqués à des mélanges classiques de produits récalcitrants présents dans les sols, sédiments et eaux souterraines. Un des objectifs du programme de dépollution est de suivre sur le terrain les processus de bio-transformation réalisés par l'ensemble des communautés bactériennes impliquées dans la bio-dépollution, et de réaliser ce suivi à l'aide d'une puce à ADN. Vous avez en charge de développer cette technologie.
1. Amplification par PCR
Dans la banque de données GenBank, vous avez récupéré les séquences d'ADN ribosomique 16S (ADNr 16S) de bactéries impliquées dans la réduction de métaux et de radionucléides. Ces bactéries appartiennent à 5 genres (« Geobacter, Desulfovibrio, Rhodococcus, Deinococcus, Metallosphaera »
). L'alignement d'une partie de ces séquences est présenté sur la figure ci-dessous. Vous pouvez constater que selon les genres considérés, cette région de l'ADNr 16S est constituée d'une partie centrale très variable encadrée par deux parties conservées présentes aux extrémités.
Vous souhaitez amplifier cette région de l'ADN 16S par la méthode PCR chez les bactéries indiquées ci-dessus et plus généralement sur un grand nombre de bactéries disponibles dans différentes collections à votre disposition.
Vous souhaitez cependant utiliser une procédure normalisée pour réaliser ces amplifications par PCR : un couple d'amorces unique et une condition d'amplification unique (températures et durées des différentes étapes, nombre de cycles...) quelles que soient les bactéries étudiées.
Question
a - Définir un couple unique d'amorces d'une longueur de 20 bases (donnez les séquences et précisez les positions) vous permettant d'amplifier la région d'ADNr 16S pour toutes les bactéries représentées sur la figure. Ce couple d'amorces vous permettra-t-il d'amplifier de façon également efficace les ADNr chez toutes les bactéries ?
pas de réponse
Question
b - Donnez les conditions d'amplification de séquence que vous allez programmer sur votre thermocycleur (durée, température...). On rappelle que vous souhaitez disposer d'une méthode de PCR normalisée qui puisse s'appliquer à différentes bactéries. On rappelle aussi que la température de fusion d'une amorce Tm peut être calculée avec la formule Tm = 4x (C+G) + 2x (A+T).
pas de réponse
2. Clonage des produits de PCR et dépôt des clones sur la biopuce
Vous avez réussi à amplifier la région ADNr 16S variable décrite dans la figure sur une centaine de bactéries de collection différentes. Afin de constituer une collection stable de cette centaine d'amplifiats, vous décidez de cloner individuellement chacun des produits PCR que vous avez obtenus dans le vecteur pBluescript.
À partir des produits PCR que vous avez amplifiés et clonés, vous fabriquez une biopuce en déposant sur une lame de verre la centaine de séquences d'ADNr 16S qui correspondent aux différentes souches bactériennes.
Question
Quel est l'intérêt d'utiliser un marqueur moléculaire comme l'ADNr 16S pour analyser la diversité microbienne d'un échantillon ?
pas de réponse
3. Optimisation de la détection d'ARN avec la biopuce
Vous vous intéressez maintenant à l'échantillon que vous allez analyser à l'aide de cette biopuce. Vous cherchez à caractériser les micro-organismes impliqués dans les processus de bio-dépollution in situ. Pour cela, vous décidez d'extraire directement les ARN totaux du sol ou du sédiment (parmi lesquels vous aurez l'ARN ribosomique (ARNr) 16S). Ces ARN totaux sont marqués par fluorescence (la méthode importe peu). Pour obtenir une détection sensible et spécifique de l'ARN sur la puce, vous testez différentes conditions d'hybridation:
