Indexage, isolement et mise en culture, observation microscopique
Avant le développement des techniques sérologiques et moléculaires, l'indexage, l'isolement et la mise en culture suivi de tests biochimiques ou d'une observation microscopique étaient des techniques de diagnostic très utilisées. Les techniques à mettre en œuvre vont essentiellement dépendre de la nature de l'organisme pathogène (virus, viroïde, phytoplasme, bactérie, champignon) et de la possibilité de les isoler et les cultiver.
L'indexage : Cette technique consiste à reproduire des symptômes de maladie sur des plantes hôtes de laboratoire (plantes indicatrices). Les plantes sont inoculées mécaniquement ou par greffage à partir d'un inoculum constitué/prélevé sur les plantes à analyser. L'indexage a ainsi été longtemps utilisé (et continue à l'être dans certaines conditions, notamment en quarantaine et dans les processus de certification) pour détecter la présence de virus, de viroïdes et de phytoplasmes. Cette technique implique cependant de disposer d'équipements adaptés « lourds » (serre de confinement), est mal adaptée à l'analyse de nombreux échantillons et demande plusieurs semaines avant d'obtenir un résultat. De plus, les symptômes obtenus peuvent être confondus avec ceux provoqués par d'autres virus. Lorsque cette technique est utilisée, elle est généralement associée à une autre technique sérologique ou moléculaire.
Les techniques d'isolement impliquant la mise en culture sur des milieux nutritifs et plus ou moins sélectifs, les tests biochimiques et l'observation microscopique restent des techniques d'actualité pour la détection et surtout l'identification de nombreux champignons et bactéries. L'étape d'isolement peut aussi souvent précéder une identification par analyse de laboratoire, sérologique ou moléculaire.
L'observation microscopique peut être utilisée pour détecter et parfois identifier un organisme pathogène, directement prélevé sur la plante à tester ou après une étape d'isolement. Par exemple, l'identification d'un champignon phytopathogène peut être basée sur l'observation au microscope des colonies obtenues sur milieu nutritif et de la morphologie des spores. Ainsi, le protocole officiel de diagnostic d'un champignon phytopathogène du blé (Tilletia indica ) associe observation morphologique des téliospores et analyse moléculaire (CIPV, NIMP27, DP4). De même, l'observation au microscope électronique (parfois associée à une technique de marquage spécifique par l'utilisation d'anticorps dirigés contre des motifs antigéniques de l'agent pathogène) peut être utilisée pour détecter et identifier des virus.
Remarque :
Ces techniques sont souvent lourdes à mettre en œuvre, sont mal adaptées au traitement de nombreux échantillons et pas toujours suffisamment sensibles et spécifiques. De plus, certains organismes pathogènes, y compris certaines bactéries, ne sont pas cultivables (bactéries viables mais non cultivables). A l'heure actuelle, ces techniques sont généralement associées à des techniques plus modernes, notamment des techniques moléculaires.
