I - Amplification d'un microsatellite
On rappelle qu'un microsatellite est une séquence très courte fortement répétée dans le génome.
Dans l'exemple ci-dessous, il s'agit de la répétition CA. Le nombre de répétition du motif CA à une même position dans l'ADN génomique est très variable selon les différents individus qui composent une population homogène
Il existe en général plusieurs endroits différents du génome qui contiennent un microsatellite d'un type particulier (le microsatellite de type CA par exemple).
On distingue bien entendu ces différents endroits par la séquence de l'ADN entourant le microsatellite, séquence que l'on ne retrouve qu'une fois dans le génome.
001 TTTTAAGTTA CTGTGTGCTT GTTGCAGGAT CTGTAACTAA TTCCTATGCG ATTCTCTTGT
061 TTGTAGGGCG AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT
121 TGGCGCCAAG TTCTGGGAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCACA CACACACACA
181 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
241 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA
301 CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACACACA CACACAACCG CCTCGGCCAT
361 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCTGAGCTCA TTGACTCTGT
421 TCTGGATGTT GTGAGGAAGG AAGCTGAGAA CTGTGACTGC TTGCAAGGAT TCCAAGTATG
481 CCACTCCCTT GGTGGTGGTA CTGGATCTGG TATGGGTACG CTGTTGATCT CAAAGATCAG
Question
1 - En considérant l'exemple ci-dessus, proposez une méthode fondée sur la PCR pour différencier différents individus de la population. Expliquez quel type de résultat on doit obtenir lorsqu'on applique la méthode que vous proposez.
On cherche à amplifier la totalité du microsatellite.
Pour deux individus ayant des nombres de répétitions CA différentes, les tailles des fragments amplifiés seront différentes, ce qui pourra être mis en évidence par simple électrophorèse.
La technique d'électrophorèse devra toutefois permettre de discriminer des fragments d'ADN dont les longueurs ne diffèrent que de 2 paires de bases (gel d'acrylamide...)
Question
2 - Déterminez la séquence de deux amorces de 20 paires de bases utilisables pour amplifier de façon spécifique le fragment contenant ce microsatellite.
Il faut impérativement réaliser les amorces à partir des séquences flanquantes du microsatellite, séquences qui sont uniques dans le génome.
On a ainsi une amplification spécifique du microsatellite considéré.
Exemple de séquences d'amorces :
5'- GTGGTGTGCGATGAACATGG -3' (140-159)
5'- CCAATTGTTACCAGCATAGG -3' (376-357)
