Mise en pratique de la PCR

II - Amplification spécifique de séquence - Partie 1

On souhaite amplifier par PCR une partie de la séquence (donnée ci-dessous) du gène de la ß-6 tubuline du maïs.

« Rappel : la taille du génome haploïde du maïs est de 5 e+9 pb »

0001 TTTTAAGTTA CTGTGTGCTT GTTGCAGGAT CTGTAACTAA TTCCTATGCG ATTCTCTTGT

0061 TTGTAGGGCG AAGATGAGGG AGATCCTGCA CATCCAGGGA GGGCAATGTG GCAACCAGAT

0121 TGGCGCCAAG TTCTGGGAGG TGGTGTGCGA TGAACATGGC ATTGACCCTA CCGGGCGGTA

0181 CACTGGCAAT TCCGACCTTC AGTTGGAGCG TGTTAATGTC TACTACAATG AAGCCTCCTG

0241 CGGACGCTTT GTTCCCCGCG CTGTTCTCAT GGATCTTGAG CCTGGGACAA TGGACAGTGT

0301 CCGGACCGGA CCCTATGGGC AGATCTTCCG CCCTGACAAC TTTGTGTTTG GGCAATCTGG

0361 TGCTGGTAAC AATTGGGCTA AGGGCCACTA CACCGAGGGT GCTGAGCTCA TTGACTCTGT

0421 TCTGGATGTT GTGAGGAAGG AAGCTGAGAA CTGTGACTGC TTGCAAGGAT TCCAAGTATG

0481 CCACTCCCTT GGTGGTGGTA CTGGATCTGG TATGGGTACG CTGTTGATCT CAAAGATCAG

0541 GGAAGAGTAC CCTGACCGCA TGATGCTTAC ATTCTCAGTT TTCCCCTCAC CGAAAGTATC

0601 TGATACCGTG GTTGAGCCAT ACAATGCCAC TCTTTCTGTC CACCAGTTGG TCGAGAATGC

0661 TGATGAGTGC ATGGTTCTCG ATAACGAAGC CCTCTATGAC ATCTGCTTCA GGACTCTTAA

0721 GCTGACCACC CCTAGCTTTG GTGATCTGAA CCATTTGATC TCTGCAACCA TGAGTGGAGT

0781 CACCTGCTGC CTAAGGTTCC CTGGTCAGCT GAACTCCGAC CTCAGGAAGC TGGCAGTGAA

0841 CCTGATCCCC TTCCCCCGTC TCCACTTCTT CATGGTCGGC TTCGCGCCGC TGACGTCCCG

0901 TGGCTCCCAG CAGTACCGGG CCCTCACAGT CCCCGAGCTC ACGCAGCAGA TGTGGGATGC

0961 CAAGAACATG ATGTGTGCCG CTGACCCTCG CCATGGGCGT TACCTCACCG CCTCGGCCAT

1021 GTTCCGCGGG AAGATGAGCA CCAAGGAGGT TGACGAGCAG ATGATCAACG TCCAGAACAA

1081 GAACTCGTCC TACTTCGTGG AGTGGATCCC CAACAACGTC AAGTCCAGCG TGTGCGACAT

1141 CCCGCCCAGG GGCCTGTCCA TGGCGTCCAC CTTCATCGGC AACTCGACCT CCATCCAGGA

1201 GATGTTCCGG AGGGTGAGCG AGCAGTTCAC TGCCATGTTC AGGAGGAAGG CTTTCTTGCA

1261 CTGGTACACG GGCGAGGGCA TGGACGAGAT GGAGTTCACC GAGGCCGAGA GCAACATGAA

1321 CGACCTCGTG TCGGAGTACC AGCAGTACCA GGACGCGACT GCCGACGAGG AGGAGTACGA

1381 GGACGAGGAG GAGGTGCAGG CCGATGACAT GTGAGGGGAG GGCTGTTATC GTGTGAAGCC

1441 TTGTGGTCCC TAGGGCAAGC GGACCTCGAT GAGTTCGGTG TTCCCTTTCG TGTTGTTGCC

1501 ATCTTTCTAC TGCTAGCGTA CCCACCCTCG TGGCCCATTC CGTCGCTGTT GACGTATGTA

1561 TTTTTCTTGT GCTATGGAAC CTTGCTTTTG GTACGGTACT ATCCTGCTAG TATGCTTGGC

1621 GTTTGAGGTT CCTGGCGTGA ATTTAAGCCT TCCGTATGCA GTGATTGGAG TTGGAGACCG

1681 GCTGCTTCGT CCAGGCGAAG CAATTGACAG CGACGTGCTA TACACTCAAG

Question

1 - Déterminez la séquence de deux amorces utilisables pour amplifier de façon spécifique environ 1 kilobase de la séquence du gène de la tubuline.

Solution

Les amorces doivent faire au moins 20 nucléotides

Séquences possibles :

5'- AACTGTGACTGCTTGCAAGG -3' (449-468)

5'- GAACACCGAACTCATCGAGG -3' (1483-1464)

Question

2 - Calculez la température de fusion (Tm) de chacune de ces deux amorces

Solution

Tm = 60°C et Tm = 62°C respectivement

Question

3 - Proposez un protocole d'amplification (température et durée des différentes étapes)

Solution

Par exemple :

94°C 1 mn, 56°C 1 mn, puis 72°C 3 mn

Question

4 - Calculez le nombre de cycles théoriquement nécessaires pour obtenir 1 µg de ce fragment en partant soit de 10 ng, soit de 500 ng d'ADN génomique

Solution

29 cycles à partir de 10 ng

24 cycles à partir de 500 ng

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