Méthodes ciblant les acides nucléiques
Avec le développement de la biologie moléculaire et l'accès au génome des organismes pathogènes, les méthodes de diagnostic ont fortement évolué ces 20 dernières années. Elles font appel à des techniques d'hybridation moléculaire[1] ou d'amplification de l'ADN[2].
Les méthodes d'amplification classiques
On assiste à une augmentation quasi-exponentielle du nombre de protocoles de diagnostic moléculaire, notamment ceux basés sur la technique de polymérisation en chaine de l'ADN (Polymerase Chain Reaction, PCR[3]). Cette technique permet d'obtenir en un couple d'heures des millions de copies d'un fragment d'ADN génomique (ou de cDNA obtenu après une étape de rétro-transcription dans le cas d'organismes ayant un génome à ARN) et apporte ainsi une sensibilité très supérieure à celle obtenue avec les méthodes plus traditionnelles. Du fait de cette sensibilité accrue, il est généralement possible de s'affranchir de l'étape d'isolement et d'enrichissement préalable pour la détection des bactéries et des champignons phytopathogènes. De même, la détection d'organismes pathogènes est possible sur tout type de matériel végétal (semences, baguettes de greffons, plante en phase végétative, etc..), lors d'infections asymptomatiques ainsi qu'à n'importe quel moment de l'année, y compris pendant les phases de dormance hivernale pour les plantes pérennes.
De nombreuses variantes ont été mises au point afin de simplifier et de raccourcir les procédures (notamment lors de l'étape d'extraction des acides nucléiques), d'augmenter la spécificité et de limiter les risques de contamination (inhérents à la grande sensibilité de la méthode). L'utilisation de la PCR en temps réel (ou PCR quantitative) pour des objectifs de diagnostic a par exemple permis de limiter les risques de faux positifs et de simplifier et raccourcir encore la procédure en permettant une lecture du signal fluorescent généré au cours du processus d'amplification de la cible.
Une grande spécificité peut aussi être obtenue via le design d'amorces ou de sondes moléculaires s'hybridant sur un motif génomique particulier, permettant ainsi la détection et l'identification spécifique de différents variants d'un même organisme pathogène. De plus, par ses capacités de multiplexage[4], la PCR facilite le diagnostic de plusieurs agents pathogènes en une seule analyse.
Remarque :
A l'heure actuelle, de nombreux protocoles de diagnostic officiels sont basés sur les techniques d'amplification PCR, et notamment de PCR en temps réel. Malgré son coût élevé et la nécessité d'équipements coûteux pour sa mise en œuvre, la sensibilité de la PCR en temps réel permet une détection précoce de nombreux pathogènes sur des plantes encore asymptomatiques. C'est l'outil de choix pour contrôler l'état sanitaire de matériel de propagation par exemple.
Nouvelles méthodes d'amplification isotherme
Ces méthodes, développées depuis une dizaine d'années, partagent avec la PCR le concept d'extension d'amorces spécifiques de la cible à amplifier par une ADN polymérase, tout en s'affranchissant des cycles thermiques de dénaturation/amorçage. La technique la plus développée est la technique LAMP (Loop-mediated isothermal amplification) ou méthode d'amplification isotherme facilitée par boucle. Contrairement à la PCR, la réaction est peu sensible aux différents inhibiteurs potentiels présents dans les échantillons et ne nécessite pas d'étapes complexes et longues de purification des acides nucléiques. La technique LAMP est ainsi simple à mettre en œuvre, permet une détection sensible et rapide (généralement en 30 min) sans avoir recours à des appareils coûteux de laboratoire et peut être réalisée sur le site même du prélèvement. La détection des produits d'amplification peut se faire facilement à l'aide d'une réaction colorée du milieu réactionnel sans avoir besoin d'ouvrir les tubes.
Techniques d'hybridation appliquées au diagnostic
Elles concernent essentiellement les puces à ADN ou biopuces. Il s'agit concrètement d'utiliser une surface de verre, de silicium ou autre sur laquelle sont liées de très nombreuses sondes, chacune d'entre elles étant spécifique d'une séquence ADN (ou ARN) d'un agent pathogène donné (ou de ses variants). Jusqu'à 30 000 sondes différentes peuvent être fixées sur une seule puce, ce qui permet la détection potentielle d'un très grand nombre de séquences différentes et donc d'un très grand nombre d'organismes différents en même temps. Le système de détection utilise un ou plusieurs fluorochromes détectés et analysés par un scanner haute résolution. Si de telles puces ont effectivement permis la détection de nombreux virus de différents genres, elles restent relativement complexes à mettre en œuvre et présentent généralement une sensibilité comparable à celle d'un TAS-ELISA[5].
